炎症性肠病患者CXCR1、IL-17的表达及其意义

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[摘要] 目的 研究炎癥性肠病（IBD）患者CXC趋化因子受体1（CXCR1）、白细胞介素-17（IL-17）的表达水平及其意义。 方法 回顾性分析2016年1月～2017年12月惠州市第三人民医院收治的IBD患者80例，其中溃疡性结肠炎（UC）患者70例（UC组），克罗恩病（CD）患者10例（CD组），另选同期在医院进行结肠镜检查的健康志愿者50例纳入对照组。比较各组血清及肠黏膜IL-17及CXCR1 mRNA表达水平，各组肠黏膜CXCR1蛋白表达水平，分析患者血清及肠黏膜IL-17与CXCR1 mRNA表达的相关性。 结果 与对照组比较，UC组及CD组血清IL-17 mRNA表达水平升高（均P < 0.05），但UC组与CD组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;各组血清CXCR1 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;与对照组比较，UC组及CD组肠黏膜IL-17及CXCR1 mRNA表达水平升高（均P < 0.05），UC组肠黏膜CXCR1 mRNA表达水平较CD组更高（P < 0.05），但两组肠黏膜IL-17表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;与对照组比较，UC组及CD组肠黏膜CXCR1蛋白表达水平升高（P < 0.05），且UC组较CD组更高，差异有统计学意义（P < 0.05）。Spearman法相关性分析发现，患者血清及肠黏膜IL-17 mRNA与CXCR1 mRNA表达呈正相关（P < 0.05）。 结论IBD患者CXCR1 mRNA和IL-17 mRNA表达升高，且患者血清及肠黏膜IL-17 mRNA与CXCR1 mRNA表达之间呈弱相关，临床上可考虑监测CXCR1和IL-17水平，从而更好地辅助治疗IBD。

[关键词] 炎症性肠病;CXC趋化因子受体1;白细胞介素-17;表达

[中图分类号] R574.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）11（b）-0099-04

Expression and significance of CXCR1 and IL-17 in patients with inflammatory bowel disease

CAI Qinghong   MA Songyan   ZHOGN Junfeng

Department of Gastroenterology， Huizhou Third People′s Hospital， Guangdong Province， Huizhou   516000， China

[Abstract] Objective To study the expression and significance of CXC chemokine receptor 1 （CXCR1） and interleukin-17 （IL-17） in patients with inflammatory bowel disease （IBD）. Methods The clinical data of 80 patients with IBD admitted to Huizhou Third People′s Hospital from January 2016 to December 2017 was analyzed retrospectively， 70 patients with ulcerative colitis （UC group）， 10 patients with Crohn′s disease （CD group）， and 50 healthy volunteers who underwent colonoscopy at the same time were selected as control group. The expression of IL-17 and CXCR1 mRNA in serum and intestinal mucosa of each group was compared， and the protein  expression of CXCR1 in intestinal mucosa of each group was analyzed. The correlation between the expression of IL-17 and CXCR1 mRNA in serum and in intestinal mucosa of patients was analyzed. Results Compared with the control group， the expression of IL-17mRNA in serum of UC group and CD group were higher （all P < 0.05）， but there was no significant difference between UC group and CD group （P > 0.05）. There was no significant difference in serum CXCR1 mRNA expression between the two groups （P > 0.05）. Compared with the control group， the expression of IL-17 and CXCR1 mRNA in intestinal mucosa of UC group and CD group was higher （P < 0.05）. The expression of CXCR1 mRNA in intestinal mucosa of UC group was higher than that of CD group （P < 0.05）， however， there was no significant difference in IL-17 mRNA expression between the two groups （P > 0.05）. Compared with the control group， the protein expression of CXCR1 in intestinal mucosa of UC group and CD group was  higher， and the protein expression of CXCR1 in UC group was higher than that in CD group （P < 0.05）. Spearman correlation analysis showed that there was a weak correlation between the expression of IL-17 and CXCR1 in serum and intestinal mucosa （P < 0.05）. Conclusion The expression levels of CXCR1 mRNA and IL-17 mRNA in serum and intestinal in IBD patients are higher， and there is a positively correlation between the expression of CXCR1 mRNA and IL-17 mRNA in serum and in intestinal mucosa. It is clinically possible to monitor the levels of CXCR1 and IL-17 to better assist in the treatment of IBD.

[Key words] Inflammatory bowel disease; CXC chemokine receptor 1; Interleukin-17; Expression

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是指一类病因不明的特发性慢性肠道炎症性疾病，多累及回肠、结直肠部位，主要包括两个独立的疾病：溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）、克罗恩病（Crohn disease，CD）[1]。该病主要临床特征包括腹痛、腹泻、黏液血便等[2]。近年来，我国IBD发病率呈不断上升趋势，且易反复性发作，对患者生活及工作造成严重不良影响[3]。据报道，该病可由疲劳、饮食失衡以及精神刺激和免疫异常等因素诱发，但多数患者为受到免疫异常影响而发病，患者主要表现出炎性细胞浸润类型黏膜炎症，并且有多种趋化因子以及其受体共同参与该病发展[4-5]。因此，深入探讨IBD发病机制，并寻找出和该病发病存在密切联系的标志物，进而为其治疗提供可靠新靶点，以提高临床IBD治疗效果，是当前研究工作的重点。有学者指出[6-7]，CXC趋化因子受体1（CXC chemokine receptor1，CXCR1）和白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）均参与IBD发病，其中CXCR1属于促炎多肽性细胞因子有关超家族的成员之一，其通常由造血微环境所含的基质细胞所分泌，能够激活及趋化机体内白细胞的移动。而IL-17主要由Th17细胞所分泌，可以激活和募集中性粒细胞不断聚集在炎症区域，同时引起或扩大机体的炎性反应。二者在IBD中的具体表达作用仍需进一步分析。本研究通过分析CXCR1和IL-17在炎症性肠病患者中的表达及其意义，旨在为临床更好地治疗IBD提供数据支持，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

2016年1月～2017年12月惠州市第三人民医院（以下简称“我院”）收治的80例IBD患者进行回顾性分析。入选标准：①所有患者的诊断均符合中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组在2012年时制定的IBD诊断及治疗共识意见[8];②年龄≥18岁;③近6个月内就诊次数>3次;④全部患者均处于疾病的活动期。排除标准：①合并其他种类的消化系统性疾病者;②有恶性肿瘤者;③有血液疾病者;④有其他严重的内科疾病者。IBD患者中，UC患者70例，纳入UC组，其中男42例，女28例;年龄30～56岁，平均（42.37±2.14）岁;病程3～7个月，平均（4.30±1.47）个月。CD患者10例，纳入CD组，其中男7例，女3例;年龄32～57岁，平均（42.41±2.03）岁;病程3～6个月，平均（4.10±1.39）个月。另选同期在医院进行结肠镜检查的健康志愿者50例纳入对照组，其中男36例，女14例;年龄31～55岁，平均（42.50±2.12）岁。三组一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂  cDNA逆转录试剂盒（Fermentas公司，生产批号：20150423）;real time PCR试剂盒（Takara公司，生产批号：20151212）;CXCR1兔抗人的多克隆抗体（Santa Cruz公司，生产批号：20150129）;羊抗兔IgG（H+L）-HRP（天津三箭生物技术有限公司，生产批号：20150611）。

1.2.2 检测各组血清IL-17及CXCR1 mRNA的表达  抽取各组的空腹静脉血约6 mL，用real time PCR测定IL-17及CXCR1 mRNA的表达情况，相关引物序列均由Takara公司提供。通过Trizol法对静脉血的RNA进行提取，取RNA产物约2 μL，用M-MLV逆转录酶常规合成cDNA，再由real time PCR仪（CFX Connect，BioRad）实施荧光定量扩增，得到CT值，并用2-△△Ct法进行计算。其中PCR的反应参数为：预变性为95℃下5 min，变性为95℃下30 s，退火为56～62℃下30 s，延伸为72℃下1 min，共30个循环，再给予10 min 72℃的终延伸。IL-17引物序列：正向引物为：5′-TCGTCCACGGGTCCTCTCTCCC-3′;反向引物：5′-GTACAGTTTTGTAAACGATGG-3′。CXCR1引物序列：正向引物：5′-CCCGTTGGATTACCAGACGAACG-3′;反向引物为：5′-CGGAAACTCTGTCCTCATGTCA-TGG-3′。将β-actin作为内对照。

1.2.3 检测各组肠黏膜IL-17及CXCR1 mRNA的表达  将提取的各组肠黏膜组织用real time PCR法测定IL-17及CXCR1 mRNA表达，其中腸黏膜组织均取自结肠镜的活检组织，对照组取志愿者正常肠段的组织。检测步骤同“1.2.2”，相关引物序列均由Takara公司提供，严格根据说明书的要求逐步实施。

1.2.4 蛋白免疫印迹法检测肠黏膜组织CXCR1蛋白的表达  通过蛋白免疫印迹法进行测定操作，将各组的20 mg肠黏膜组织在研磨并粉碎之后添加100 μL冷蛋白裂解液（①50 mmol/L的Tris-HCL;②pH为7.5;③150 mmol/L的NaCl;④1%的NP-40;⑤0.1%的SDS;⑥对每100 μL的裂解液添加1 μL 100 mmol/L的PMSF液），待其充分裂解之后给予3 min 4℃下10 000 r/min的离心，离心半径12.5 cm，提取上清液并检测蛋白浓度。将40 μg蛋白同上样缓冲液进行混合，并煮沸5 min，给予SDS-PAGE，再电转移到PVDF膜，用5%BSA配制的脱脂牛奶予以封闭，再添加二抗行室温孵育2 h，用TBST缓冲液清洗3次，最后用增强化学发光法进行曝光显影，并应用Image J软件进行蛋白质定量分析。

1.3 观察指标

比较各组血清及肠黏膜IL-17及CXCR1mRNA表达水平，各组肠黏膜的CXCR1蛋白表达水平，分析患者血清及肠黏膜IL-17与CXCR1表达的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，其中计数资料采用χ2检验;计量资料以均数±标准差（x±s）表示;多组间比较采用方差分析，组间计量资料两两比较采用LSD-t检验。采用Spearman进行相关性分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清IL-17及CXCR1 mRNA表达水平比较

与对照组比较，UC组及CD组血清IL-17 mRNA表达水平升高（均P < 0.05），但UC组与CD组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;各组血清CXCR1 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 各组肠黏膜IL-17、CXCR1 mRNA表达及CXCR1蛋白表达水平比较

与对照组比较，UC组及CD组肠黏膜IL-17 mRNA、CXCR1 mRNA及CXCR1蛋白表达水平升高（均P < 0.05）;与CD组比较，UC组肠黏膜CXCR1 mRNA及CXCR1蛋白表达水平升高（P < 0.05），但UC组与CD组肠黏膜IL-17 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.3 患者血清及肠黏膜IL-17 mRNA与CXCR1 mRNA表达的相关性分析

Spearman相关性分析发现，患者血清及肠黏膜IL-17与CXCR1表达呈正相关（r = 0.435、0.505，P = 0.043、0.038）。

3 讨论

临床将IBD分为UC以及CD两种类型，其中UC为结肠黏膜层以及黏膜下层等出现的连续性炎性反应，其多数首先累及患者直肠，而后不断向全结肠蔓延。而CD则是累及整个消化道，属于非连续性质全层炎症，最易累及位置包括末端回肠以及结肠、肛周等。目前临床对于该病发病机制以及治病因素等均无确切定论，有学者指出，该病的发病机制较复杂，主要是由环境、遗传以及感染和免疫等多种因素共同导致[9-12]。同时，临床研究显示，肠道黏膜自身免疫系统发生异常反应，并引发系列炎性反应，是IBD患者发病的关键[13-14]。因此，IBD发病与免疫功能异常之间存在直接联系，使得有关肠道免疫功能紊乱问题的研究成为当前IBD疾病研究的重点。

本研究发现，与对照组比较，UC組及CD组血清IL-17 mRNA表达水平更高（P < 0.05），但UC组与CD组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;而UC组及CD组肠黏膜IL-17及CXCR1 mRNA表达水平与对照组比较明显升高，且UC组肠黏膜CXCR1 mRNA表达水平较CD组明显更高（P < 0.05），但IL-17 mRNA差异无统计学意义（P > 0.05）。这与胡梅等[15]的报道结果一致。提示IL-17及CXCR1均可能参与到IBD的发病过程中，但二者的作用机制有所差异。CXCR1能够特异性地结合IL-17，并介导相应的中性粒细胞趋化和磷脂酶D的活化，及超氧化物的形成，在IBD中重点参与到UC的发病过程当中，并与UC的活动性紧密相关[16]。而IL-17则主要可能是通过促进白细胞释放过量的化学因子引起组织炎症的发生，最终强化了肠道内的炎性反应而导致IBD的形成[17]。同时，本文还发现，与对照组比较，UC组及CD组肠黏膜CXCR1蛋白表达水平升高（P < 0.05），且UC组较CD组更高（P < 0.05），再次提示了CXCR1蛋白虽然可参与到IBD的发病，但以UC为主。进一步分析发现，患者血清及肠黏膜IL-17与CXCR1 mRNA表达呈正相关。这提示了炎症因子与趋化因子之间存在着一定程度的联系，主要由于多种炎症细胞不断向肠道转移，并且释放出大量趋化因子。以上炎症细胞以及趋化因子等共同参与IBD发生，并造成炎症损伤[18]。趋化因子是指一种通过组织细胞以及炎症细胞合成并分泌，具备对炎症细胞进行趋化募集以及活化等功能的蛋白质，其能够和相应受体相结合，并诱导炎症细胞不断趋化游走，介导其向发生炎症位置聚集，并且活化[19]。CXC为趋化因子一个典型亚家族，与其相结合的受体则是CXC受体，CXCR1为其中一个类型。CXC与CXCR可以互相结合并发挥出一定生物学功能，且对炎性反应产生一定作用[20-21]。IL-17则具备较高的炎症活性，其可通过引起下游多类细胞因子及趋化因子表达，不断招募机体的中性粒细胞和巨噬细胞迁移至炎症部位区域，从而产生组织损伤，而肠道内的微生物及局部性的细胞因子微环境则共同促使了IL-17的表达[22]。因此，监测CXCR1和IL-17有利于更好地辅助治疗IBD。这在Verstockt等[23]的报道中也有类似的结论可加以佐证。

综上所述，IBD患者CXCR1和IL-17呈高表达，且患者血清及肠黏膜的IL-17与CXCR1表达呈正相关，临床上可考虑监测CXCR1和IL-17水平，从而更好地辅助治疗IBD。

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（收稿日期：2019-01-23  本文编辑：刘永巧）

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