RPMI,1640体外培养结肠小袋纤毛虫的正交试验

摘要:利用L9(34)正交试验,研究了淀粉量、小牛血清比例和初始pH值3个因素对结肠小袋纤毛虫在RPMI 1640培养基中最高种群密度的影响。方差分析结果表明,初始pH值对最高种群密度影响最大,其次为小牛血清比例,淀粉量影响最小。最佳培养基组成为淀粉40mg/瓶、血清25%(RPMI 1640培养液2.25mL+小牛血清0.75mL);最适宜的RPMI 1640培养液初始pH值为7.0。

关键词:结肠小袋纤毛虫;正交试验;RPMI 1640培养基

中图分类号:S852.72+4文献标识码:A文章编号:1007-273X(2010)08-0006-02

结肠小袋纤毛虫病(Balantidiosis)是由结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)引起的人畜共患寄生虫病,呈世界性分布,主要流行于热带和亚热带地区。目前已知有人及33种动物可以感染该病。人感染后在临床上可表现为腹痛、腹泻、里急后重等症状,有些病例还可表现为泌尿生殖道感染,对人体健康危害较大[1]。猪结肠小袋纤毛虫感染非常普遍,感染率可高达20%～100%[2]。目前,国内外对结肠小袋纤毛虫的研究主要集中在流行病学的调查、临床病例的诊断和治疗等方面,而其致病机理仍然不明,因此,有必要通过其体外培养体系的建立,进行该虫的生物学、致病机制、免疫及药物筛选等研究[3]。RPMI 1640培养基常用于细胞培养,而结肠小袋纤毛虫是单细胞的原生动物,初步试验表明,在RPMI 1640培养基中加入适量淀粉、小牛血清可用于结肠小袋纤毛虫的培养,为进一步优化培养基组成,进行了正交试验。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1虫种采自洛阳市孟津县某猪场自然发病的病猪粪便,直接镜检发现有大量滋养体。取粪便样少许接种于改进型RSS培养基,在28℃条件下培养48h,镜检后发现大量活动滋养体后用于试验[4]。

1.1.2试剂RPMI 1640培养基,10.4g装,Lot

No.2535081,GIBCOTM;小牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司生产,批号为090324;碳酸氢钠,西安化学试剂厂生产,批号为080423,分析纯;可溶性淀粉,北京海淀区微生物培养基厂生产,批号080417,用前取适量装入洁净小瓶中高压灭菌;青霉素和链霉素(用前用pH值为7.0的0.1MPBS分别稀释成20万IU/mL)。

1.2方法

1.2.1RPMI 1640培养基配制 RPMI 1640培养基用无菌双蒸馏水溶解,每1 000mL加2.0g NaHCO3。培养基用G6滤器除菌,4℃保存,使用前根据需要用盐酸或氢氧化钠溶液调整pH值。

1.2.2正交试验设计根据以往的工作经验,选影响虫体繁殖的淀粉量、小牛血清比例和初始pH值3个因素进行试验,每个因素选3个水平,利用L9(34)正交表,考查上述3个因素对结肠小袋纤毛虫体外繁殖性能的影响。具体试验方案见表1,为保证试验结果的重复性,每个试验组设计两个平行样品,进行有重复观测值正交试验[5]。

1.2.3虫体接种及结果观察本试验用安瓿瓶进行培养,每个安瓿瓶内液体总量为3mL,按比例加入相应pH值的RPMI1640培养基和小牛血清,并加入相应量的淀粉。一个试验号设两个平行样品,分别进行标记,作为单位组Ⅰ和单位组Ⅱ进行统计分析。培养基制备完成后,每个安瓿瓶内滴加青霉素和链霉素各1万IU/mL。每个安瓿瓶内加结肠小袋纤毛虫滋养体悬液100μL。检查初始密度后,将安瓿瓶加盖后放入28℃条件下培养,每12h检查一次,直至样品种群密度连续两次下降为止。检查时,将每一个样品混匀后取40μL,滴于载玻片上,盖上盖玻片(18mm×18mm),于100×镜暗视野下检查,计数30个视野下的虫体数。

1.2.4数据分析以每一个安瓿瓶内最高种群密度为基本数据,利用有重复观测值正交试验方差分析法进行结果分析,考查不同因素各水平对获得最高密度的影响,同时,利用多重比较(SSR法)确定某一因素3个水平中最佳水平,最后确定培养基最佳组成。

2结果

2.1试验结果

在初始接种量均为8个/30个视野的情况下, 除试验号3、5、7种群密度在接种培养后108h达到最高值外,其余样品均于96h达到密度最高值。L9(34)正交试验结果见表2。

2.2方差分析

由表2的极差可以看出,3个因素对获得最高种群密度的影响主次顺序为C(初始pH值)、B(小牛血清比例)和A(淀粉量)。对表2的结果进行方差分析,其结果见表3。由于MSe1/MSe2>1,MSe1与MSe2差异显著,以MSe2进行F检验和多重比较。F检验结果表明,淀粉量、血清比例及初始pH值对获得最高种群密度均有极显著影响(P<0.01)。两个单位组间差异不显著(P>0.05)。

2.3各因素不同水平下最高种群密度平均数的多重比较

利用SSR法对各因素不同水平下最高种群密度平均数进行了多重比较,结果见表4、表5及表6。40mg/安瓿(A3)条件下所获得的最高种群密度极显著高于30mg/安瓿(A2)及20mg/安瓿(A1)(P<0.01),而后两者差异不显著(P>0.05)。血清比例为25%(B3)的条件下所获得的最高种群密度显著高于20%(B2)(P<0.05),极显著高于15%(B1)(P<0.01),后两者差异极显著(P<0.01)。初始pH为7.0(C2)条件下所获得的最高种群密度极显著高于6.0(C1)及8.0(C3)(P<0.01),后两者差异也极显著(P<0.01)。

2.4最佳培养基组成的确定

根据总体分析结果,A因素各水平中A3最好,B因素中B3最好,C因素中C2最好,因此最优组合为A3B3C2,即淀粉量为40mg/安瓿,血清量为25%,初始pH值为7.0。

3讨论

RPMI 1640含有较为丰富的营养成分,加一定比例的血清可用于细胞培养,但利用此培养基培养结肠小袋纤毛虫国内外尚未见报道[3]。在初步试验时,用此培养基培养结肠小袋纤毛虫,虫体密度在小幅度增长后很快衰落。后来在培养基中加入适量的淀粉,则虫体可以很好地生长繁殖。为了取得良好的培养基组成,本试验利用正交试验研究了结肠小袋纤毛虫在RPMI 1640培养基上再培养效果,并进行了有重复观测值的方差分析,最终确定了最佳培养基组成。在上述因素中,培养液初始pH值是最大的影响因素,在初始pH值设定为7.0时所取得的最高种群密度显著高于6.0和8.0,这与利用RSS或改进型RSS培养基培养时的pH值为7.0～7.5要求基本一致[4,6]。所不同的是,利用RSS或改进型RSS培养基培养时初始pH值为6.5及8.0时,虫体在初期少量增殖后密度迅速下降,表现明显的不适应性,而本次试验发现,在这两种初始pH值条件下,虫体仍然有一定繁殖能力,其原因有待进一步研究[7]。

利用RPMI 1640培养基培养结肠小袋纤毛虫比RSS或改进型RSS培养基具有更多优点。RPMI 1640培养基配制及使用方便,在适宜的pH值条件下,可获得较高的种群密度,最高种群密度可达500个以上/30个视野,而在RSS或改进型RSS培养基上最高仅可获得200个左右/30个视野[4,6],因此,在今后的研究中,可用RPMI 1640培养基取代RSS或改进型RSS培养基进行结肠小袋纤毛虫的体外培养。

参考文献:

[1]蒋金书.动物原虫病学[M].北京:中国农业大学出版社,2000. 329-333.

[2]SOLAYMANI M S,PETRI W A J. Zoonotic Implications of the Swine-transmitted Protozoal Infections [J]. Veterinary Parasitology,2006,140: 189-203.

[3]SCHUSTER F L,LYNN R A. Current world status of Balantidium coli[J]. Clinical Microbiology Reviews,2008,21(4): 626-638.

[4]王天奇,丁轲,张玲,等.改进型RSS培养基体外培养结肠小袋纤毛虫的效果研究[J].湖北畜牧兽医,2008(10):6-8.

[5]明道绪.生物统计附试验设计[M].北京:中国农业出版社,2002.311-314.

[6]王天奇,闫文朝,丁轲,等.RSS培养基体外培养结肠小袋纤毛虫的效果观察[J].中国兽医寄生虫病,2008,16(6):17-21.

[7]张绍丽,马洪钢,宋微波.海洋纤毛虫—巨大拟阿脑虫的实验生态学研究Ⅲ.pH对种群生长的影响[J].应用与环境生物学报,2001,7(3):244-247.

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