多维指纹图谱在中药质量评价中的应用

[摘要] 本文综述了自2000年以来提出多维指纹图谱之后多维指纹图谱技术的发展及其在中药质量控制中的应用。就建立多维指纹图谱的一些联用技术（HPLC-DAD、HPLC-DAD-MS、HPLC-DAD-ELSD、HPLC-DAD-NMR、CE-MS、GC-MS）在多维指纹图谱研究中的优点及应用做一概述，综述了各种色谱及光谱指纹图谱联用的特点，简要阐述了国内外多维指纹图谱的研究在中药质量评价中的应用情况。本文认为多维指纹图谱能够更全面地评价中药的质量。中药指纹图谱的发展必将是多仪器、多测定方式联用的多维指纹图谱。

[关键词] 中药；色谱技术；光谱技术；多维指纹图谱

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（c）-0164-04

Application of multi-dimensional fingerprints in TCM quality evaluation

CAO Ling LIU Lili WANG Lianzhi FU Lei

College of Pharmacy， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China

[Abstract] This paper reviews the development of multi-dimensional fingerprint technology and the application of this technology in the quality control of traditional Chinese medicine after multi-dimensional fingerprint was put forward since 2000. The paper summarizes the advantage and application in the study of multi-dimensional fingerprint of some hyphenated techniques， such as HPLC-DAD， HPLC-DAD-MS， HPLC-DAD-ELSD， HPLC-DAD-NMR， CE-MS and GC-MS， which established multi-dimensional fingerprint. The features of the various combination between chromatographic fingerprints with spectroscopic fingerprints were reviewed. The application of multi-dimensional fingerprints in the quality assessment of traditional Chinese medicine at home and abroad is briefly described. This paper considers that multi-dimensional fingerprints can more comprehensively evaluate the quality of traditional Chinese medicine. The development of the fingerprints of traditional Chinese medicines will certainly be a combined multi-dimensional fingerprints with many instruments and various measure manners.

[Key words] Traditional Chinese medicine； Chromatographic technique； Spectroscopic technique； Multi-dimensional fingerprint

中药指纹图谱是指中药材、提取物或中药制剂等经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材、提取物或中药制剂特性的共有峰的图谱。从1984年香港中文大学中药研究中心提出了开展中药成分“指纹”鉴定工作的设想以来，我国就开始了指纹图谱的研究[1]。国家药品监督管理局于2000年颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》[2]，要求中规定，为确保中药注射剂质量稳定、可控，中药注射剂在固定了中药材品种、产地和采收期的前提下，需要制订中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。特别是在《中国药典》（2010年）中，建立了能反映中药整体特性的色谱指纹图谱方法（如满山红油、薄荷素油、积雪草总苷、莪术油、丹参酮提取物、丹参总酚酸提取物、三七总皂苷和三七三醇皂苷等药材及其提取物）。指纹图谱技术在我国中药质控方面得到了迅速发展。

2000年罗国安等[3]提出了多维指纹图谱的概念。多维指纹图谱，即采用多种分析仪器联用的模式来建立指纹图谱（如HPLC-DAD-MS、HPLC-MS-MS、GC-MS、CE-MS[4]）。多维指纹图谱的优点是在色谱分离的同时还能进行光谱的在线检测，从而产生的数据既包括色谱的化学信息又包括光谱的信息。因此，这一方法特别适合中药及其制剂这一复杂体系的测定。

建立多维指纹图谱的组合方式主要包括：不同柱子的串并联、不同检测器的串并联、不同色谱方法的组合及不同仪器间的组合。建立多维指纹图谱的一些常见联用技术主要有高效液相色谱-光电二极管阵列检测器（HPLC-DAD）、高效液相色谱-光电二极管阵列检测器-质谱（HPLC-DAD-MS）、高效液相色谱-光电二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器（HPLC-DAD-ELSD）、高效液相色谱-光电二极管阵列检测器-核磁（HPLC-DAD-NMR）、毛细管电泳-质谱（CE-MS）、气相色谱-质谱（GC-MS）等。

1 HPLC-DAD

高效液相色谱仪的DAD检测到的图谱是三维谱图，用DAD建立指纹图谱，得到的图谱就是最简单的多维指纹图谱。DAD的光栅在流通池后，用阵列二极管同时测定各个波长的光强度，因此在每一个色谱时间点上都可以同时得到紫外光谱图，而且得到的光谱图会随着色谱保留时间方向上的化学成分和浓度的不同而发生变化。测得的数据中既包含色谱信息也包含光谱信息。色谱的保留时间结合光谱信息可以用来进行定性鉴定，而色谱的峰高与峰面积等可以用来进行定量检测[5]。

谢显珍等[6]利用HPLC-DAD建立了黄芪药材中黄酮类化合物的色谱指纹图谱。在利用联用色谱提供的色谱以及光谱信息的基础上，利用一些化学计量学方法获取了主要黄酮类物质的光谱图，将这些光谱图与标准图谱相对照，以定性指纹图谱中主要的黄酮类组分，进而表征和建立了不同产地黄芪药材中黄酮类化合物特征色谱指纹图谱。此外，胡建兰等[7]利用HPLC-DAD建立了凉膈散汤剂的指纹图谱，建立了该方汤剂整体特征的质量评价方法。侯志飞等[8]利用HPLC-DAD建立了栀子及其炮制品指纹图谱，应用在线紫外光谱对指纹峰进行了定性归属研究。胡虒尧等[9]建立了当归芍药散的HPLC-DAD指纹图谱，根据HPLC图中各峰的保留时间和DAD检测的紫外光谱图的进行比对，认定了峰的来源，对方中部分特征峰进行了归属。袁晓等[10]建立了茜草HPLC-DAD指纹图谱，提供了茜草药材的质量控制方法。

2 HPLC-DAD-MS

质谱检测器（MSD）在选择性、通用性、灵敏度和化合物的分子量及结构信息的提供等方面均有较突出的优点。HPLC-DAD-MS联用技术实现了在分离成分时，能够在线提供各指标性成分或活性成分化学结构信息，能够提供深层次分析信息的工具，而且检测的高灵敏度可以解决一些药材近缘品种指纹图谱中虽然有指纹特征，但信号微弱，又有必要辨认组分的分析[11]。

早在2001年，戴德舜等[12]及曹进等[13]就利用HPLC-DVD-MS-MS技术对桂枝汤A部分双向调节样品及单向升温样品进行指纹图谱的确定。该实验分析了MS总离子流图及高效液相谱图主峰对应的可能分子量，根据药典和桂枝汤中五种单味药有效成分的相关资料，推测出了桂枝汤A部分双向调节作用的物质基础可能对应单味药的物质来源。并且利用LC-MS联用技术对桂枝汤A部分以及组成桂枝汤五味单味药A部分进行多维全息化学特征谱的指认。通过Mass的质荷比（M/Z）值及HPLC色谱峰的保留时间相互对照，将桂枝汤A部分中主要成分进行归属，为进一步研究药效作用的走向提供了有效途径。聂晶等[14]采用HPLC-UVD对生血宁片的指纹图谱进行了研究，并利用UPLC/DAD/Q-TOF-MS技术对其中主要色谱峰进行了归属，为更好地控制生血宁片质量提供可靠依据。

3 HPLC-DAD-ELSD

蒸发光散射检测器（ELSD）的工作原理是，色谱柱流出物经过蒸发器将流动相蒸发，待测成分变成微粒气雾流，一定强度的光照射此微粒，测定其散射光，散射光的强度取决于测定的微粒的大小和多少，而与其结构关系不大。因此，对于没有紫外吸收的皂苷类等化合物来说，用ELSD特别适合。DAD可检测出有共轭体系的化合物的特征吸收，ELSD可检测皂苷类化合物等紫外吸收不明显的化合物的吸收信息。应用二极管阵列检测-蒸发光散射检测联用测定中药材及其制剂可有效的互补。

闫艳等[15]建立了酸枣仁药材HPLC-DAD-ELSD指纹图谱。现代药理研究表明，酸枣仁中镇静催眠的主要有效成分是皂苷类和黄酮类。皂苷类成分大多没有明显的紫外吸收，用紫外检测器测定效果不好，基线漂移严重，相应值低。应用ELSD测定皂苷类成分效果好，基线稳定，有很好的响应值。因此，采用HPLC-DAD-ELSD法既能测定酸枣仁药材中的黄酮类成分，又能测定皂苷类成分，一次进样可同时测得两类成分的指纹图谱，从而使得对酸枣仁的质量评价更加全面。此外，苏碧茹等[16]采用HPLC-DAD-ELSD串联技术建立了黄芪药材的HPLC-DAD-ELSD色谱指纹图谱，为黄芪药材的全面质量控制提供了科学依据。石媛慧等[17]采用DAD串联ELSD建立不同品种石斛的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱，可直接反映石斛品种与化学成分变化的关系。

4 HPLC-DAD-NMR

核磁共振波谱法（NMR）是将自旋核放入磁场，用适宜频率电磁波照射它们，其吸收能量，发生原子核能级跃迁，同时会产生核磁共振信号，从而得到核磁共振谱。核磁共振谱能够提供的参数主要有化学位移、质子的裂分峰数、偶合常数及各组峰的积分高度等。而这些参数与有机化合物的结构有着非常密切的关系。故此，核磁共振谱是鉴定有机化合物、金属有机化合物及生物分子结构和构象等的重要工具之一。NMR作为一种波谱型指纹图谱与HPLC这一色谱型指纹图谱相结合，在中药材及中药复方这一复杂体系中将所有成分的信息尽可能多的表现出来，具全面性和整体性的优势。

林云良等[18]建立了金银花的HPLC-DAD-NMR指纹图谱。采用高效液相色谱法及核磁共振的方法，对山东产金银花的乙醇提取物中的活性成分进行了系统的研究，建立了其指纹图谱。此两种方法联用作为检测手段能够很好地表征中药材及其制剂的内在化学成分特征及其相对之间含量差异。

5 CE-MS

毛细管电泳法（CE）是指带电质点（胶粒或离子）在电解质溶液中在电场的作用下，向荷电相反电极迁移的现象称为电泳。因为带电质点的电荷数量、电荷符号和质点大小的差别，迁移速度有所不同，从而分离。电泳若是在毛细管中进行的则为毛细管电泳法。毛细管电泳法不仅能分离分析有机化合物，无机阴、阳离子，手性分子，中性分子和大分子，而且具有柱效高、样品用量少、分析速度快、应用范围广等特点。CE指纹图谱具有很好的专属性，当与高灵敏度的质谱检测器联用时，能够得到较低的检测限。此外，质谱还可以提供分子量用于定性，多级质谱还可以提供结构的碎片信息，而用于结构鉴定。因此，毛细管电泳质谱联用技术用于中药的研究，应用前景比较广阔。孙毓庆等[19]系统总结了毛细管电泳指纹图谱以及毛细管电泳-质谱联用技术在中药质量控制中的作用。

6 GC-MS

气相色谱法（GC）是以气体为流动相的色谱分离技术。在中药质量现代化的研究过程中，气相色谱法有较为重要的地位。对于含有挥发性成分、主要成分为脂肪酸类的中药材及挥发油等成分的质量控制有着不可替代的作用和比较理想的分离效果。气相色谱法和质谱联用具有比较好的定性功能，使中药材及其制剂指纹图谱的研究更加系统和完整，并且为解决中药研究中缺乏标准品提供了可行之路。

华永丽等[20]建立了当归及其炮制品挥发油的GC-MS化学指纹图谱。以当归及其不同炮制品为样品，以气相色谱-质谱联用技术为分析方法，运用统计分析手段，建立了从化学指纹图谱中发现不同炮制品潜在标志物的方法。耿放等[21]建立了桂枝茯苓丸脂溶性成分GC-MS指纹图谱，从整体定性方面评价桂枝茯苓丸的质量优劣。潘瑞景等[22]对不同产地半枝莲药材及其混淆品的GC-MS指纹图谱进行研究，证明了九个不同产地半枝莲具有统一性，与混淆品之间具有明显的差异。

7 不同仪器的组合

用不同仪器建立指纹图谱，这些仪器在技术上及在原理上能够优势互补，能够合理交叉地整合定性信息，为综合鉴定中药质量的全貌奠定基础，这为寻找中药大复方体系的标准制剂提供一种探索模式，且具有现实性、有效性、可靠性和可操作性。

孙国祥等[23-24]建立了防风通圣丸及柏子养心丸的高效液相色谱指纹图谱、紫外光谱指纹图谱、红外光谱指纹图谱及热值谱，形成多元多维方法交叉评价防风通圣丸质量的方法。用190～400 nm的紫外区间紫外光谱指纹图谱表达π→π*，n→π*和n→σ*的化学组分，用4000～400 cm-1红外光谱指纹图谱表达单键、双键及三键等的振动（或转动）对中红外线的吸收，这些均以光谱点为评价单元。用燃烧焓衡量中药的有机物达到高价氧化态的热释放度，以此来揭示有机组分的总量。故以此四种多元多维指纹图谱的交叉整合能够监测中药各类化学成分分布的情况，为中药的质量控制提供了一种简单探索性的方法。此外，陈新新等[25]建立了六味地黄丸（浓缩丸）的五波长高效液相色谱指纹图谱、紫外指纹图谱和导数指纹图谱，为其药效物质均一性的评价提供了一种有效的方法。孙国祥等[26]建立了维C银翘片紫外指纹图谱、红外指纹图谱及测定燃烧热，利用两种光谱指纹图谱实现对中药全化学成分的（双键、三键和饱和键）全面监测。

总之，中药及其制剂化学成分非常复杂，用单一指纹图谱不能兼顾所有化学成分。多维指纹图谱实现了分析方法多元化和检测方式的多维化，能够获得中药的立体空间指纹图谱。多维指纹图谱实现了分析方法多元化和检测方式的多维化，从而能够获得中药的立体空间指纹图谱。由于多元多维指纹图谱技术从多元的分析方法和多维的检测方式来获得中药化学组分的全信息而形成立体多息谱，因此，只有对其进行合理的整合和有效的数据挖掘才能够从多侧面、整体方位详细描述及准确表征中药中全部组分的含量分布状况[23]。故此，多维指纹图谱目前面临的难题是如何快速找到适合的评价分析方法，从而建立科学的评价体系，能够解释和评价中药中包含的药效成分信息，能够把数据的应用从低层次的简单查询，提升到在数据中挖掘知识，获取数据背后潜在的、有用的信息，以此来描述中药多维指纹图谱的整体特征，对于现阶段而言，亟需解决的问题是将各种联用方式、各种仪器得到的数据进行合理的整合，从而达到全面控制中药及其制剂的质量。希望能够建立切实有效的中药指纹图谱，为中药质量控制服务，使对中药及其制剂的质量评价更加全面准确。多维指纹图谱的出现即是为了更加全面地反映中药各类成分的全貌，因此，中药指纹图谱的发展必将是多仪器、多测定方式的联用的多维指纹图谱。

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